Aplicação de espectrometria de massas na caracterização de interações proteína-proteína

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Lima, Tatiani Brenelli de, 1990-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636352
Resumo: Orientadores: Fabio Cesar Gozzo, Juliana Helena Costa Smetana
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spelling Aplicação de espectrometria de massas na caracterização de interações proteína-proteínaCharacterization of protein-protein interaction by mass spectrometryEspectrometria de massaProteômica estruturalLigação cruzadaInteração proteína-proteínaMass spectrometryStructural proteomicsCross-linkingProtein-protein interactionsOrientadores: Fabio Cesar Gozzo, Juliana Helena Costa SmetanaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuímicaResumo: A técnica de ligação cruzada associada à espectrometria de massas (XL-MS) baseia-se na união covalente de resíduos de aminoácidos estruturalmente próximos por meio de um agente de ligação cruzada (ALC). O ALC atua como uma régua molecular gerando informações a respeito da distância em que os resíduos reativos encontram-se na estrutura terciária e quaternária de proteínas. A técnica de troca de hidrogênio-deutério associada à MS (HDX-MS) consiste na troca de átomos de hidrogênio lábeis por átomos de deutério presentes na solução. Essa técnica fornece informações sobre mudanças conformacionais e dinâmica de proteínas e complexos proteicos. A Hsp90 é uma chaperona molecular essencial para células que exerce um papel fundamental na homeostase. A Hsp90 atua também no processo de translocação de proteínas do citosol para as mitocôndrias via complexo TOM, por meio da interação entre os domínios C-terminal da Hsp90 (CHsp90) e o citosólico da proteína Tom70 (Tom70C). As características estruturais do complexo CHsp90-Tom70C foram investigadas utilizando XL-MS e HDX-MS. Os resultados demonstraram uma nova região de interação entre essas proteínas que envolve a hélice A7 da Tom70C e o peptídeo TLRQKAEADKNDKSVKDLVILLY presente na Hsp90. Ensaios de importações mitocondriais confirmaram essa nova região de interação. Os resultados permitiram propor um modelo estrutural de baixa resolução para o complexo CHsp90-Tom70C e ampliar as informações descritas na literatura quanto ao mecanismo de importação de pré-proteínas para mitocôndria. A PP2A, segundo alvo desta tese, é uma serina/treonina fosfatase que atua em diversos processos celulares e é um importante supressor tumoral. A holoenzima funcional da PP2A é heterotrimérica e composta por uma subunidade ancoradora, regulatória e catalítica (PP2Ac). A sequência conservada do extremo C-terminal (306DYFL309) da PP2Ac sofre modificações pós-traducionais que regulam a interação com outras subunidades e conferem seletividade ao substrato. A TIPRL é uma proteína conservada que interage e inibe a atividade da PP2Ac. Existe uma escassez nas informações sobre os mecanismo regulatórios e estruturais no processo de biogênese da PP2A e também do papel da TIPRL. Estudos utilizando co-imunoprecipitação combinada com western blot e MS foram propostos para analisar o processo de biogênese da PP2A comparando duas isoformas da PP2Ac: ativa e inativa. Informações estruturais da regulação da PP2A por TIPRL foram obtidos usando XL-MS e HDX-MS para estudar a estrutura e dinâmica da TIPRL em solução e complementar dados de cristalografia. Os resultados da biogênese da PP2A evidenciaram que esse processo ocorre em um tempo menor que 48 horas. O cristal da TIPRL humana é um novo fold, composto por folhas betas e uma fenda ligada a um peptídeo derivado do sítio de clivagem da enzima TEV. O peptídeo co-cristalizado (LYFQ) apresenta similaridade de sequência com o extremo C-terminal da PP2Ac. Análises de HDX-MS utilizando TIPRL e os tetrapeptídeos sintéticos (DYFL e DpYFL) demonstram que o extremo C-terminal da PP2Ac interage nessa fenda e existe maior afinidade com o peptídeo não fosforilado. Essas descobertas abrem novas vias de desenvolvimento de fármacos, já que a fenda na TIPRL pode ser alvo de fármacos para liberar a atividade da fosfatase em células cancerígenasAbstract: Chemical cross-linking followed by mass spectrometry (XL-MS) involves the covalent linkage of amino acids that are close in space by using chemical agents (cross-linkers). The cross-linkers act as molecular rules that provide information on distances between the cross-linked amino acids residues in the tertiary and quaternary structure of proteins. The hydrogen-deuterium exchange is a chemical reaction in which label hydrogen of proteins is replaced by a deuterium in solution. This technique coupled to mass spectrometry (HDX-MS) is used to study the conformation and dynamics of proteins and complexes. Hsp90 is a molecular chaperone that is crucial to maintain cellular homeostasis. Hsp90 also facilitates the transport of preproteins from the cytosol to the mitochondria via TOM complex, through interaction between cytosolic domain of Tom70 (Tom70C) and C-terminal domain of Hsp90 (CHsp90). Structural insights of CHsp90-Tom70C complex were investigated using XL-MS and HDX-MS. This strategy has identified a novel region of contact between CHsp90-Tom70C (TLRQKAEADKNDKSVKDLVILLY and helix A7, respectively). The new interface was confirmed via mitochondrial import assays. The results allowed to generate a low resolution molecular model to the CHsp90-Tom70C complex and fulfill information of the mechanism which preproteins are translocated via Tom70 to the mitochondria. Protein phosphatase 2A (PP2A) is a serine/threonine phosphatase in cells, which acts in several cellular processes and is an important tumor suppressor. Functional PP2A holoenzymes are heterotrimers composed of scaffold, regulatory and catalytic (PP2Ac) subunits. The catalytic subunit has a conserved C-terminus (306DYFL309) that undergoes post-translational modifications, which regulate the interactions with the other subunits and confer substrate selectivity. TIPRL is a conserved protein that binds and inhibits PP2Ac. There is a dearth of information regarding the regulatory and structural mechanisms in the assembly of PP2A heterotrimers and the possible role of TIPRL. Co-immunoprecipitation combined to western blot and MS were used to study the biogenesis process of PP2A using two PP2Ac isoforms: active and inative. The structural basis of regulation of PP2A by TIPRL was obtained using XL-MS and HDX-MS to understand the dynamics of TIPRL in solution and complement crystallographic data. The PP2A biogenesis analysis indicate that this process takes up to 48h. The crystal structure of human TIPRL is a new fold with beta-sheet core and a cleft bound to a peptide derived from TEV mediated cleavage of the affinity tag. The TEV-derived peptide (LYFQ) which co-crystallized had a striking similarity with the conserved C-terminus of PP2Ac. The HDX-MS analysis with TIPRL and synthetic tetrapeptides (DYFL and DpYFL) showed that this binding site in TIPRL structure actually harbors the C-terminus of PP2Ac and that TIPRL has a clear preference for the non-phosphorylated peptide. These findings open new drug development avenues as the presence of a druggable pocket in TIPRL could be targeted to release phosphatase activity in cancer cellsDoutoradoQuímica OrgânicaDoutora em CiênciasCAPESCNPQ203800/2017-6[s.n.]Gozzo, Fábio Cesar, 1972-Smetana, Juliana Helena Costa, 1983-Benedetti, Celso EduardoNogueira, Fábio César SousaFavaro, Denize CristinaFill, Taicia PachecoUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de QuímicaPrograma de Pós-Graduação em QuímicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASLima, Tatiani Brenelli de, 1990-20182018-03-19T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (134 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636352LIMA, Tatiani Brenelli de. Aplicação de espectrometria de massas na caracterização de interações proteína-proteína. 2018. 1 recurso online (134 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636352. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1089318Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2019-06-26T10:57:20Zoai::1089318Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2019-06-26T10:57:20Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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