Metodologias para análise de experimentos de Dual RNA-seq: aplicação da melhor estratégia no estudo das interações entre Azospirillum brasilense e milho durante a inibição da produção de Ácido Indol-3-Acético pela planta

• Autor(a) principal: Espindula, Eliandro
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/212911
• topic: Azospirillum brasilense; Bactérias de crescimento vegetal; Zea mays; Auxina; Transcriptoma

Uma forma de elevar a produção vegetal sem aumentar a área plantada é através do uso de bactérias promotoras de crescimento vegetal. Entre essas bactérias estão as do gênero Azospirillum, encontradas na rizosfera de gramíneas e cereais, tanto em climas tropicais como em climas temperados. As principais características das bactérias desse gênero são a capacidade de fixar nitrogênio e a de produzir fitormônios, estimulando, assim, o crescimento das plantas. O presente estudo teve como objetivo melhorar a compreensão sobre a interação de Azospirillum e milho, em nível genético, em relação à ação do ácido indol-3-acético (AIA) nas plantas. Esse fitormônio é muito importante para o crescimento vegetal, principalmente através da estimulação da produção de raízes secundárias. Para esta finalidade, foi aplicado nas plantas o composto químico Yucasin [5-(4-chlorofenil) -4H-1,2,4-triazol-3-tiol], que é um potente inibidor de uma das enzimas da principal via de produção de AIA pelas plantas, a YUCCA. Plântulas de milho, inoculadas ou não com Azospirillum brasilense FP2, foram submetidas ao tratamento com Yucasin por 5 horas. Amostras de raízes de cada condição experimental foram utilizadas para a extração de RNA e para a construção das respectivas bibliotecas de cDNA. Uma vez que a metodologia utilizada foi de Dual RNA-seq, fez-se necessário o aprimoramento da forma de análise dos dados gerados após o sequenciamento das bibliotecas de cDNA, constituídas de amostras de RNA de ambos os organismos. Apesar de a maioria dos trabalhos de Dual RNA-seq utilizar a análise sequencial dos dados, a análise combinada, na qual se compara simultaneamente os dados, parece ser a mais indicada. Nesse tipo de análise, as bibliotecas são alinhadas contra um arquivo composto pelos genomas de ambos os organismos de forma concatenada, antes da etapa de mapeamento das sequências contra os respectivos genomas anotados. Para verificar a eficácia da metodologia combinada em relação à sequencial foram utilizadas bibliotecas de cDNAs disponíveis em bancos públicos e bibliotecas oriundas de um experimento prévio realizado em nosso laboratório. A metodologia sequencial atribuiu um número maior de sequências ao primeiro genoma utilizado (devido ao mapeamento cruzado) do que a metodologia combinada. Também, a quantidade de mapeamento cruzado foi menor na análise combinada do que na sequencial, evidenciando a importância da utilização da análise combinada em experimentos de Dual RNA-seq, a fim de se evitar a perda de informações, principalmente em relação ao organismo procariótico. A análise combinada foi aplicada para analisar as bibliotecas de cDNA do experimento Azospirillum-milho, na presença ou não de Yucasin. Com essa metodologia foi possível observar em milho genes diferencialmente expressos que codificam proteínas da via de resposta ao ácido abscísico (ABA) e fatores de transcrição evolvidos nas respostas a estresses bióticos e abióticos. Esses resultados indicam que a planta respondeu à presença da bactéria e do Yucasin. Dados fisiológicos mostraram que o AIA produzido pela bactéria foi suficiente para recuperar o fenótipo das plantas submetidas ao tratamento com Yucasin. Com relação à bactéria, foram identificados genes diferencialmente expressos que codificam proteínas que participam do transporte transmembrana e da biossíntese de terpenoides.