Efeitos do veneno da serpente Bothrops jararaca sobre a agregação e secreção plaquetária de plaquetas humanas e de camundongos

• Autor(a) principal: Rosa, Jaqueline Gomes
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5167/tde-15012019-082126/
• topic: Agregação plaquetária; Blood platelets; Bothrops; Bothrops jararaca; Camundongos; Espectrometria de massas; Hermansky-Pudlak syndrome; Humans; Mass spectrometry; Mice; Plaquetas; Platelet aggregation; Platelet secretion; Secreção plaquetária; Seres humanos; Síndrome de Hermansky-Pudlak; Snake venoms; Thrombocytopenia; Trombocitopenia; Venenos de serpentes

Trombocitopenia e diminuição da função plaquetária são achados comuns em pacientes picados por serpentes do gênero Bothrops. Sabe-se que o veneno de Bothrops jararaca (VBj) apresenta compostos com características pró e anti-agregantes plaquetárias, porém existem poucos estudos sobre a influência do veneno total assim como das principais famílias de proteínas que o compõem sobre as funções plaquetárias. A utilização de modelos experimentais é essencial para entender as desordens plaquetárias em humanos que culminam em sangramentos diversos. Portanto, o objetivo deste estudo foi (i) comparar as respostas ex vivo de plaquetas lavadas de humanos e de camundongos frente ao VBj, assim como entender a participação de serinaproteinases (SVSP) e metaloproteinases (SVMP) presentes no veneno sobre a agregação dessas plaquetas; e (ii) delimitar dentro do complexo proteico do veneno os compostos que induzem a trombocitopenia em camundongos após 3 horas do início do envenenamento botrópico. As plaquetas lavadas de humanos e camundongos BALB/c, C57BL/6 e do mutante natural pérola (Ap3b1-/-) apresentaram respostas de agregação máxima ao VBj na concentração de 24,4 ?g/mL, porém esta concentração provocou uma agregação menos intensa em plaquetas humanas quando comparada àquela observada nas linhagens BALB/c e C57BL/6. Mesmo em plaquetas de camundongos pérolas, deficientes em corpos densos plaquetários, o VBj se mostrou um potente agonista, promovendo a agregação plaquetária sem a necessidade da secreção do conteúdo granular. A ação agonista do veneno promoveu a secreção de ATP presente nos corpos densos plaquetários de humanos e das linhagens BALB/c e C57BL/6 de forma tão intensa quanto à provocada pela trombina, assim como a secreção de PF4 presente nos grânulos ? de plaquetas humanas e de camundongos BALB/c. Já em relação à secreção lisossomal, observou-se que as plaquetas humanas secretam níveis mais baixos de ?-hexosaminidase quando estimuladas com VBj do que pela trombina, enquanto que em plaquetas de camundongos BALB/c a secreção lisossomal ao VBj foi superior à constatada com a trombina. Os baixos níveis de lactato desidrogenase (LDH) no sobrenadante das plaquetas estudadas mostraram ausência de atividade direta citotóxica pelo VBj. Para verificar se as principais classes de famílias de enzimas do VBj, SVMP e SVSP, estavam envolvidas na ativação plaquetária ex vivo, elas foram inibidas com Na2EDTA (13 mM) e AEBSF (8 mM), respectivamente. Observou-se que em plaquetas humanas as serinaproteases são importantes para a agregação ex vivo, enquanto a agregação das plaquetas de camundongos BALB/c foi independente dessa classe de toxinas. Os resultados dos ensaios in vivo demonstraram que as proteínas do VBj com peso molecular inferior a 50 kDa (UF < 50 kDa) são importantes para o estabelecimento da trombocitopenia em camundongos BALB/c que receberam essa fração por via subcutânea e que esse quadro é independente de manifestações hemorrágicas e do desenvolvimento de coagulopatia durante o envenenamento botrópico. A caracterização dos compostos presentes no UF < 50 kDa foi realizada por espectrometria de massas e foi observada a presença predominante de metaloproteinases (37%) e proteínas similares às lectinas do tipo-C (33%), enquanto serinaproteases (17%), fosfolipases A2 (10%) e outros compostos (3%) somaram 30% da fração UF < 50 kDa. Em conclusão, o veneno é um potente agonista plaquetário que promove agregação, aglutinação e secreção de plaquetas humanas e de camundongos, independente da secreção de corpos densos plaquetários, e a fração do veneno responsável pela trombocitopenia em camundongos BALB/c tem peso molecular menor que 50 kDa