O papel das proteínas dedo de zinco TcZC3H39, TcZC3H29 e TcZC3HTTP no metabolismo de RNA do Trypanosoma cruzi

• Autor(a) principal: Romagnoli, Bruno Accioly Alves
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/44368
• topic: Nocaute Gênico; Gene Expression Regulation; RNA-Binding Proteins; Zinc Fingers; CRISPR-Associated Protein 9; Regulación de la Expresión Génica; Proteínas de Unión al ARN; Dedos de Zinc; Proteína 9 Asociada a CRISPR; Régulation de l'expression des gènes; Protéines de liaison à l'ARN; Doigts de zinc; Protéine-9 associée à CRISPR; Regulação da Expressão Gênica; Trypanosoma cruzi; Proteínas de Ligação a RNA; Dedos de Zinco; Proteína 9 Associada à CRISPR

A regulação pós-transcricional da expressão gênica é essencial para a adaptação e sobrevivência do Trypanosoma cruzi às diferentes condições impostas pelos seus hospedeiros durante seu ciclo de vida. Parte dessa regulação é exercida por proteínas de ligação ao RNA (RBPs) que interagem com os RNAs e coordenam seus destinos na célula. Dentre as diferentes famílias de proteínas que compõem o repertório de RBPs no T. cruzi, estão as que apresentam o domínio dedo de zinco C3H. As proteínas TcZC3H39, TcZC3H29 e TcZC3HTTP possuem esse domínio e foram objetos de estudo de trabalhos anteriores, os quais avaliaram a expressão, localização celular e os possíveis transcritos alvos dessas proteínas. Uma estratégia que permite avaliar um fenótipo associado a um gene específico é a utilização de abordagens de genética reversa como o nocaute gênico. Recentemente a implementação do sistema de edição gênica CRISPR/Cas9 emergiu como um método alternativo às estratégias existentes, em geral de baixa eficiência, para realização de nocaute gênico em T. cruzi. Sendo assim, como forma de avaliar o papel dessas três proteínas dedo de zinco na regulação da expressão gênica desse parasito, propôs-se utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para nocautear os genes de TcZC3H39, TcZC3H29 e TcZC3HTTP e avaliar os respectivos fenótipos associados. Inicialmente, propôs-se uma adaptação às estratégias descritas anteriormente para o nocaute gênico via sistema CRISPR/Cas9 em T. cruzi. Após o estabelecimento dessa metodologia, partiu-se para o nocaute dos genes tczc3h39 e tczc3h29 e tczc3http. A indução do nocaute dessas RBPs promoveu grandes alterações morfológicas no ciclo celular, além do comprometimento da viabilidade dos parasitos afetados, sugerindo que esses genes poderiam ser essenciais para o T. cruzi. No entanto, apesar das evidências de disrupção dos genes tczc3h29 e tczc3http a nível proteico, não foi possível confirmar a edição desses genes a nível de DNA. Para contornar essa situação, implementou-se na estratégia de nocaute desenvolvida a presença de uma molécula de DNA simples fita (DNA donor), contendo um sítio de restrição enzimático e sequência correspondente a códons de paradas, para direcionar o reparo e garantir a disrupção gênica dos genes alvos. A incorporação do DNA donor à estratégia reduziu, mas não eliminou, a presença dos fenótipos aberrantes encontrados na indução do nocaute dessas RBPs, indicando, portanto, uma relação entre os fenótipos observados e os genes afetados. A partir dessa nova adaptação, foi observada a presença de parasitos hemi-nocautes para TcZC3H39, TcZC3H29 ou TcZC3HTTP. Uma nova eletroporação, com gRNAs e DNA donors para edição do alelo remanescente, resultou na obtenção de clones nocautes para TcZC3HTTP. Apesar de viáveis, os parasitos apresentaram uma redução na proliferação na ausência de TcZC3HTTP. Os clones hemi-nocautes para TcZC3H39 e TcZC3H29 também impactaram negativamente na curva de crescimento de T. cruzi, sustentado a possibilidade desses genes serem essenciais para esse parasito. Todavia, novas tentativas de se obter mutante nulos para essas duas RBPs estão em curso. Dessa forma, a partir desses resultados, novas perspectivas se abrem para o aprofundamento do estudo não só das proteínas TcZC3H39, TcZC3H29 e TcZC3HTTP, mas também para todas as RBPs em T. cruzi.