Characterization of orphan CFTR mutations
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| Data de Publicação: | 2017 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/31920 |
Resumo: | Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017 |
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Characterization of orphan CFTR mutationsCFTRFibrose quísticaMutações orfãsTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A fibrose quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população caucasiana, afetando 1 em 2500-6000 recém-nascidos. Esta doença é causada por mutações no gene Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). A proteína CFTR funciona como um canal de cloreto (Cl-) e bicarbonato (HCO3-) regulado por cAMP e é expressa na membrana apical de várias células epiteliais. Para além disso, a CFTR também regula outros canais de iões e transportadores, entre os quais o canal de sódio (Na+) epitelial (ENaC). Desta forma, a CFTR influencia o conteúdo em água e iões do líquido que reveste as vias respiratórias (airway surfasse liquid - ASL). A sua desregulação leva a uma redução do volume do ASL e consequentemente a um muco muito espesso e desidratado que impede a limpeza mucociliar e leva à acumulação de bactérias e agentes patogénicos. Isto leva a infeções persistentes, inflamação e, eventualmente, à fibrose e destruição do tecido das vias respiratórias, sendo esta a principal causa de morte. A proteína CFTR pertence à superfamília dos transportadores ABC (do inglês ATP binding cassette), sendo constituída por 5 domínios distintos: dois domínios transmembranares (MSDS1 e MSD2), formados por 6 segmentos transmembranares cada, e que em conjunto constituem o poro do canal; dois domínios de ligação ao ATP (NBD1 e NBD2) e um domínio regulador (R), que contém múltiplos locais de fosforilação – sendo responsáveis pela abertura e fecho do canal A proteína CFTR é sintetizada no retículo endoplasmático onde é glicosilada cotraducionalmente, dando origem a uma forma imatura (designada band B). Esta proteína sofre depois processamento, durante o seu tráfego pelo complexo de Golgi, originando uma proteína madura (banda C) que vai para a membrana celular onde funciona como canal de cloreto. Até à data, já foram descritas mais de 2000 mutações no gene CFTR, a maior parte das quais causadoras de fibrose quística. A deleção do resíduo de fenilalanina na posição 508 (F508del) é a mutação mais comum e causa um defeito no trafego e na função devido ao misfolding da proteína. Eventualmente, todas as mutações resultam num transporte deficiente de água e iões no epitélio. No entanto, de acordo com o defeito provocado por cada mutação, essa alteração no transporte pode ser mais ou menos grave (ausência total ou transporte residual de cloreto no epitélio, respetivamente). Assim, as mutações foram agrupadas em sete classes de acordo com o defeito causado. Nas mutações de classe I não há produção de proteína, sendo normalmente mutações nonsense, nas quais a existência de um codão stop prematuro leva à degradação do mRNA por nonsense-mediated decay (NMD); as mutações de classe II levam ao folding e processamento incorreto da CFTR, ficando a proteína retida no reticulo endoplasmático (RE) e posteriormente degradada pelo sistema ubiquitina-proteassoma; as mutações de classe III impedem o funcionamento do canal, sendo maioritariamente mutações localizadas nos NBDs; as mutações de classe IV levam a uma baixa condutância, localizando-se maioritariamente nos MSD1 e MSD2; as mutações de classe V resultam em diminuição dos níveis de CFTR, normalmente devido a defeitos no splicing; nas mutações de classe VI, a proteína é pouco estável na membrana celular; e por fim, as mutações de classe VII levam a que não haja produção de mRNA CFTR, sendo muito difícil a sua correção usando fármacos (ex: grandes deleções). As consequências funcionais causadas por uma determinada mutação podem gerar defeitos celulares que resultam na inclusão de uma dada mutação em mais que uma classe - é o caso da mutação F508del que possui defeitos que tanto a classificam como uma mutação de classe II (retenção intracelular) como de classe III (abertura reduzida do canal). De entre as cerca de 2.000 mutações no gene CFTR, muitas são variantes pouco comuns, sendo designadas de mutações “órfãs”. Para estas mutações, é difícil prever os efeitos da mutação pois a mutação ainda não foi caracterizada em termos funcionais e porque na maioria dos casos existem em heterozigotia com outras mutações. Para além disto, como estas mutações afetam poucos pacientes, é difícil não só fazer o diagnóstico, mas também testar os fármacos já existentes (e aprovados) para mutações mais comuns. Assim, há uma necessidade de fazer uma caracterização funcional destas mutações órfãs a fim de se poder fazer a validação de compostos que levem à correção especifica de cada mutação. Para o estudo da fisiopatologia da fibrose quística têm sido desenvolvidos vários modelos. De forma a se poder estudar a CFTR no seu ambiente natural, ou seja, na membrana das células, é importante usar células com um fenótipo epitelial e que tenham capacidade de polarizar e estabelecer tight junctions para se poder medir o transporte iónico. Estas células são normalmente imortalizadas e são manipuladas de forma a que expressem a proteína CFTR wt ou mutante. Quando é requerido um modelo que represente melhor o epitélio das vias respiratórias, são usadas células primárias do epitélio nasal ou dos brônquios - estas podem ser obtidas através de biópsias/escovados ou pólipos nasais ou isolados a partir de materiais de doentes após transplante pulmonar. Outro tipo de sistema são os organoides intestinais, que são produzidos a partir de células estaminais primárias das criptas do reto e podem ser cultivados em matrigel por longos períodos de tempo sem modificações genéticas. Este sistema tem a vantagem de poder ser usado para ensaios funcionais nos quais a ativação da CFTR pela forskolin leva à secreção de sais e fluido para o lúmen no organoide, levando ao seu inchamento (forskolin-induced swelling - FIS). Assim, embora seja fisiologicamente relevante o uso de materiais de doentes para estudar os mecanismos de doença e testar possíveis estratégias terapêuticas, estes necessitam de ser complementados com modelos celulares, pois a maioria das mutações aparecem em heterozigotia, e é difícil de perceber o efeito de cada uma individualmente. Assim as linhas celulares produzidas neste trabalho são indispensáveis para o estudo de mutações raras. Este trabalho teve como principal objetivo a caracterização de mutações órfãs no gene CFTR - nomeadamente as mutações P205S, L206W, R334W, R347P, I507del, R553P, R560S, L997F, H1079P, M1101K e D1152H. Estas foram estudadas a nível funcional e molecular, usando novos modelos celulares. Para além disto, testámos se os fármacos já existentes para mutações comuns são eficazes nestas mutações. Para isto foram levadas a cabo as seguintes tarefas: (i) Criação de novas linhas celulares (baseadas na linha CFBE) que sobre-expressam de forma estável cada uma das mutações em estudo; (ii) Estudo do efeito de cada mutação a nível funcional e molecular usando diferentes técnicas (Western blot, imunofluorescência, câmara de Ussing); (iii) Avaliação do efeito de drogas (já aprovadas para mutações comuns) nestas novas linhas celulares. A primeira tarefa foi concluída para as mutações P205S, R334W, R560S e H1079P. Células CFBE (Cystic fibrosis bronchial epithelial) foram usadas como modelo celular, tendo sido estavelmente transduzidas com cada mutante (com recurso a vetores lentivirais). As restantes mutações foram estudadas usando células HEK293T transfetadas transientemente. Todas as mutações foram estudadas em termos de processamento (presença ou ausência da forma matura da proteína -banda C - por WB) da proteína CFTR e as mutações P205S e R560S foram também estudadas do ponto de vista funcional (determinação de transporte transepitelial em câmara de Ussing). Para as mutações em que se observou um defeito no processamento, foi testado o corrector VX-809 -componente do fármaco combinado lumacaftor/ivacaftor aprovado pela FDA e EMA. Os resultados neste trabalho mostram que: • As mutações P205S, L206W, I507del, R553P, R560S, H1079P e M1101K levam a um defeito no processamento (banda C ausente ou bastante reduzida). • O defeito de processamento das mutações L206W, R553P e M1101K é corrigido pelo corretor VX-809. • O defeito de processamento causado pelas mutações I507del e H1079P não é corrigido pelo VX-809. • O defeito de processamento causado pela mutação R560S não é corrigido por nenhum dos compostos testados (VX-809, VX-661, cisteamina – isolada ou combinada com o epigalocatequinagalato) nem pela incubação a baixa temperatura. • As mutações R334W, R347P, L997F e D1152H não levam a um defeito no processamento, gerando possivelmente uma deficiência a nível funcional. A continuação do trabalho desenvolvido neste projeto será importante para a melhor compreensão do efeito de cada mutação e para a identificação de compostos já disponíveis (aprovados ou em ensaio clínico) levam à sua correção. Assim este trabalho contribuirá para a descoberta de novas abordagens terapêuticas para pacientes que possuem mutações raras como as que aqui foram estudadas.Cystic Fibrosis (CF) is the most common lethal autosomal recessive disorder in the Caucasian population, affecting 1 in 2,500-6,000 newborns. CF is caused by mutations in the CF Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene, being the most common a deletion of a phenylalanine residue at position 508 (F508del) that disrupts its traffic and function, due to protein misfolding. CFTR functions as a cyclic AMP-regulated chloride (Cl-) and bicarbonate (HCO3-) channel at the apical membrane of a variety of epithelial cells, also controlling several other ion channels and transporters, such as the epithelial sodium (Na+) channel (ENaC). CFTR influences the ion and water content of the airway surface liquid (ASL). Its dysregulation, leads to a reduced ASL volume and consequently thick and dehydrated airway mucus. This thick mucus then impairs the mucociliary clearance (MCC) and causes the accumulation of bacteria and other pathogens, leading to persistent infections, inflammation and eventually to airway fibrosis and lung destruction, which is the primary cause of mortality in CF patients. CFTR is synthesized at the endoplasmic reticulum (ER) where it is co-translationally coreglycosylated, generating an immature form (called band B). The protein is then processed during its trafficking through the Golgi apparatus to produce its fully-glycosylated mature form (band C) that functions as a channel at the cell surface. About 2,000 alterations have been described to date in the CFTR gene, most presumed to be CF-causing. Ultimately, all of them result in defective cAMP-regulated Cl- secretion by epithelial cells but due to different reasons. This great diversity led to the grouping of CFTR alterations into several classes according to the basic functional defect caused by each mutation, so as to be targeted by the same therapeutic strategy. Among the ~2,000 CFTR mutations, many of them are very rare variants - termed “orphan” mutations due to their low frequency, >1,000 existing in less than 5 patients worldwide. For some of these mutations, the prediction of disease outcome is difficult, since the functional defect has not been characterized. In addition, as they affect very few patients, it is difficult not only to establish the diagnosis and prognosis, but also to assess the potential of new mutation-based therapies. Nevertheless, it is likely that some of these mutations will respond to already approved CFTR modulator drugs. Thus, there is an unmet need to functionally characterize these orphan mutations to establish validated drugs for mutation-based therapies. The main goal of the present work was to better characterize a set of 11 CFTR orphan mutations which occur in Portuguese CF patients (P205S, L206W, R334W, R347P, I507del, R553P, R560S, L997F, H1079P, M1101K and D1152H), at the cellular level by novel cellular models and to test the efficacy of existing CFTR corrective drugs on these mutations. To accomplish this goal, the following tasks were proposed: (i) to generate novel cell lines stably expressing each of the CFTR mutants in study; (ii) to assess the molecular and functional effect of each CFTR mutant, using different approaches (Western blot, immunofluorescence and Ussing chamber); (iii) to test the efficacy of already approved drugs (for more common CFTR mutations) on these CFTR mutants expressed in the novel cell lines. The first task was accomplished for the mutations P205S, R334W, R560S and H1079P. CF bronchial epithelial (CFBE) cell models stably expressing the above mutants were generated. The remaining mutations were studied using HEK293T cells transiently transfected with each CFTR mutant. All the above mutations were studied in terms of processing (no appearance of fully glycosylated form, i.e. band C in WB assays) and for both R560S and P205S, also in terms of function (Ussing chamber assays). For the mutations that showed processing defects, the corrector VX-809, part of the FDA/ EMA-approved lumacaftor/invacaftor drug, was tested. Overall the results showed that: 1. Mutations P205S, L206W, I507del, R553P, R560S, H1079P and M1101K cause processing defects (abrogating or drastically reducing the production of band C). 2. Among these seven mutations affecting processing, P205S-, L206W-, R553P- and M1101KCFTR are rescued by the corrector VX-809. 3. Mutations R334W, R347P, L997F and D1152H did not cause a defect in processing – thus are likely to cause CF by impairing CFTR function. The continuation of the work developed during this project will be important to further characterize the cellular effect of each mutation and to assess whether they can be rescued by the already approved drugs in order to contribute to bringing these novel therapeutic approaches to CF patients carrying such rare mutations.Farinha, Carlos,1973-Amaral, Margarida,1958-Repositório da Universidade de LisboaRamalho, Sofia Santos2019-10-29T01:30:18Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/31920TID:201857189enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:25:44Zoai:repositorio.ul.pt:10451/31920Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:47:16.036943Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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