Evidências de uma interação direta entre os receptores Mas e AT2
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2013 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFMG |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/1843/BUBD-9D8GKJ |
Resumo: | O receptor para angiotensina II, subtipo 2 (AT2) e o receptor Mas para Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)], possuem ações fisiológicas protetoras semelhantes. Estudos mostram interações funcionais entre os receptores Mas e AT2, no entanto um estudo específico focado na interação Mas/AT2 , ainda não foi realizado. Este estudo demonstra uma interação molecular e funcional entre os receptores Mas e AT2. A interação molecular Mas/AT2 foi avaliada por transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), realizada em células HEK-293 vivas utilizando vetores de expressão que codificam os receptores Mas e AT2 fundidos à proteínas de fluorescência CFP ou YFP. A eficiência de FRET foi determinada usando o método de recuperação da fluorescência doadora (CFP) após fotodegradação da proteína aceptora (YFP). Interações funcionais entre os receptores AT2 e Mas foram avaliadas comparando os efeitos produzidos pela excitação concomitante de ambos os receptores com os efeitos produzidos pela ativação do receptor Mas ou AT2 separadamente. Avaliamos os efeitos da ativação concomitante Mas/AT2 na sensibilidade do barorreflexo em ratos espontaneamente hipertensos (SHR), na preparação de anel aórtico de ratos Wistar e na liberação de Óxido Nítrico (NO) em células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectadas. Desenvolvemos camundongos duplo nocaute para os receptores Mas e AT2 em dois tipos de background diferentes, C57BL/6 (B6) ou FVB/N, e avaliamos a função endotelial dos mesmos. Nossos resultados mostram eficiência de FRET de 10,8 ± 0,8% para a heterodimerização dos receptores Mas e AT2. Eficiência de FRET para homodimerizaçoes foram observadas, 7,4 ± 0,8% para o homodimero do Mas e 9,2 ± 0,8% para o homodimero do AT2. A Interação Mas/AT2 é específica, uma vez que (i) nenhuma eficiência de FRET foi observada quando um outro receptor de membrana (TRPC6) foi testado para heterodimerização com o Mas ou AT2, (ii) a expressão do MAS e AT2 não fluorescentes competiu com a eficiência da FRET na heterodimerizacao Mas/AT2. Adicionalmente, a mutação na Cisteína 35 (N terminal) do receptor AT2 reduziu significativamente a eficiência de FRET sugerindo que uma ligação dissulfeto envolvendo a C35 do receptor AT2, pode ser responsável pela heterodimerização entre os receptores Mas e AT2. A infusão intracérebro ventricular (ICV) de Ang-(1-7) ou do agonista do receptor AT2, Composto 21 (C21), aumentaram a sensibilidade do barorreflexo (1,0 ± 0,13 batimentos/min/mmHg) e (0,93 ± 0,12 batimentos/min/mmHg) respectivamente quando comparado aos grupos controles (0,60 ± 0,09 batimentos/min/mmHg) e (0,60 ± 0,08 batimentos/min/mmHg, p <0,05), respectivamente. Curiosamente, não houve mudança significativa na sensibilidade do barorreflexo quando o C21 foi infundido concomitantemente com a Ang-(1-7) (antes, 0,56 ± 0,04 e 3 horas após a infusão ICV 0,52 ± 0,1 batimentos/min/mmHg). No ensaio em anel aórtico, o efeito vaso-relaxante de Ang-(1-7) foi bloqueado após a administração do C21 (10-6 M) 10 minutos antes de Ang-(1-7). Curiosamente, em células CHO que expressam estavelmente o receptor Mas, a liberação de óxido nítrico Mas-Ang-(1-7) mediado, não foi afetada pela pré-incubação, 10 minutos antes, com C21. É possível, que o efeito inibitório do C21 sob a resposta vasorelaxante produzida pela Ang-(1-7) não tenha sido observado no ensaio de liberação de óxido nítrico, em razão à ausência em CHO do receptor AT2. Nos camundongos Mas/AT2 duplo nocaute com background FVB/N evidenciamos disfunção endotelial e vascular. A principal evidência fornecida neste estudo, é que os receptores Mas e AT2 se heterodimerizam e esta interação mostrase de relevância funcional, demonstrada por ensaios In vitro e In vivo. |
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Robson Augusto Souza dos SantosDaniel Campos Villela2019-08-11T17:22:35Z2019-08-11T17:22:35Z2013-09-05http://hdl.handle.net/1843/BUBD-9D8GKJO receptor para angiotensina II, subtipo 2 (AT2) e o receptor Mas para Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)], possuem ações fisiológicas protetoras semelhantes. Estudos mostram interações funcionais entre os receptores Mas e AT2, no entanto um estudo específico focado na interação Mas/AT2 , ainda não foi realizado. Este estudo demonstra uma interação molecular e funcional entre os receptores Mas e AT2. A interação molecular Mas/AT2 foi avaliada por transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), realizada em células HEK-293 vivas utilizando vetores de expressão que codificam os receptores Mas e AT2 fundidos à proteínas de fluorescência CFP ou YFP. A eficiência de FRET foi determinada usando o método de recuperação da fluorescência doadora (CFP) após fotodegradação da proteína aceptora (YFP). Interações funcionais entre os receptores AT2 e Mas foram avaliadas comparando os efeitos produzidos pela excitação concomitante de ambos os receptores com os efeitos produzidos pela ativação do receptor Mas ou AT2 separadamente. Avaliamos os efeitos da ativação concomitante Mas/AT2 na sensibilidade do barorreflexo em ratos espontaneamente hipertensos (SHR), na preparação de anel aórtico de ratos Wistar e na liberação de Óxido Nítrico (NO) em células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectadas. Desenvolvemos camundongos duplo nocaute para os receptores Mas e AT2 em dois tipos de background diferentes, C57BL/6 (B6) ou FVB/N, e avaliamos a função endotelial dos mesmos. Nossos resultados mostram eficiência de FRET de 10,8 ± 0,8% para a heterodimerização dos receptores Mas e AT2. Eficiência de FRET para homodimerizaçoes foram observadas, 7,4 ± 0,8% para o homodimero do Mas e 9,2 ± 0,8% para o homodimero do AT2. A Interação Mas/AT2 é específica, uma vez que (i) nenhuma eficiência de FRET foi observada quando um outro receptor de membrana (TRPC6) foi testado para heterodimerização com o Mas ou AT2, (ii) a expressão do MAS e AT2 não fluorescentes competiu com a eficiência da FRET na heterodimerizacao Mas/AT2. Adicionalmente, a mutação na Cisteína 35 (N terminal) do receptor AT2 reduziu significativamente a eficiência de FRET sugerindo que uma ligação dissulfeto envolvendo a C35 do receptor AT2, pode ser responsável pela heterodimerização entre os receptores Mas e AT2. A infusão intracérebro ventricular (ICV) de Ang-(1-7) ou do agonista do receptor AT2, Composto 21 (C21), aumentaram a sensibilidade do barorreflexo (1,0 ± 0,13 batimentos/min/mmHg) e (0,93 ± 0,12 batimentos/min/mmHg) respectivamente quando comparado aos grupos controles (0,60 ± 0,09 batimentos/min/mmHg) e (0,60 ± 0,08 batimentos/min/mmHg, p <0,05), respectivamente. Curiosamente, não houve mudança significativa na sensibilidade do barorreflexo quando o C21 foi infundido concomitantemente com a Ang-(1-7) (antes, 0,56 ± 0,04 e 3 horas após a infusão ICV 0,52 ± 0,1 batimentos/min/mmHg). No ensaio em anel aórtico, o efeito vaso-relaxante de Ang-(1-7) foi bloqueado após a administração do C21 (10-6 M) 10 minutos antes de Ang-(1-7). Curiosamente, em células CHO que expressam estavelmente o receptor Mas, a liberação de óxido nítrico Mas-Ang-(1-7) mediado, não foi afetada pela pré-incubação, 10 minutos antes, com C21. É possível, que o efeito inibitório do C21 sob a resposta vasorelaxante produzida pela Ang-(1-7) não tenha sido observado no ensaio de liberação de óxido nítrico, em razão à ausência em CHO do receptor AT2. Nos camundongos Mas/AT2 duplo nocaute com background FVB/N evidenciamos disfunção endotelial e vascular. A principal evidência fornecida neste estudo, é que os receptores Mas e AT2 se heterodimerizam e esta interação mostrase de relevância funcional, demonstrada por ensaios In vitro e In vivo.The angiotensin AT2-receptor (AT2R) and the MAS-receptor for angiotensin 1- 7 [Ang-(1-7)] both belong to the protective arm of the Renin Angiotensin System (RAS). They behave in a very similar way in terms of their physiological (tissue-protective) actions. Studies show some functional MAS/AT2 interactions, but a specific study focusing this interaction has not yet been done. In this study we show a molecular and functional interaction between these two receptors. The molecular interaction between MAS and AT2R was assessed by fluorescence resonance energy transfer (FRET) performed in live HEK-293 cells using expression vectors encoding Mas or AT2R fused in the C-terminus with CFP or YFP. FRET efficiencies were determined by monitoring the increase in the CFP (FRET-donor) fluorescence emission during selective YFP (FRET-acceptor) photobleaching. Functional interactions of AT2R and Mas were assessed compering the effects produced by concomitant excitation of both receptors with the well-known effects produced by activation of the Mas receptor alone. In this way, we evaluated the effects of a Mas/AT2 concomitant activation in baroreflex sensitivity in spontaneously hypertensive rats (SHR), in wistar rats aortic ring preparation and in NO release from transfected chinese hamster ovary cell (CHO). Finally, we developed and evaluated the endothelial function of Mas/AT2 double knockout mice with two different backgrounds, C57BL/6 (B6) and FVB/N. Our results show a significant FRET efficiency of 10.8±0.8% when AT2-YFP and MAS-CFP were co-expressed indicating heterodimerisation. Both, MAS and AT2R also formed homodimers as demonstrated by FRET efficiencies of 7.4±0.8% or 9.2±0.8%, respectively. Receptor interactions were specific as no FRET efficiency was observed with an unrelated transmembrane receptor, and expression of non-fluorescent MAS and AT2R competed with FRET efficiencies. Further more, a mutation in the Cys35 of the AT2 receptor reduced significantly the FRET efficiency suggesting that a disulfide bond in this site may be responsible for the heterodimerization between the receptors. Intra-cerebral ventricular (ICV) infusion of Ang-(1-7) or the AT2 R agonist, Compound 21 (C21), baroreflex sensitivity (1.0 ± 0,13 beats/min/mmHg) and (0.93 ± 0,12 beats/min/mmHg) when compared with there controls (0.60 ± 0,09 beats/min/mmHg) (0,60 ± 0,08 beats/min/mmHg; p<0.05) respectively. Interestingly, there was no significant change in barorreflex sensitivity when C21 was infused concomitantly with Ang-(1-7) (before, 0.56 ± 0,04 and 3h after ICV infusion 0,52 ± 0,1 beats/min/mmHg). In the aortic ring assay, the vasorelaxant effect of Ang-(1-7) was blocked after a C21 (10-6 M) administration, 10 minutes before Ang-(1-7). Interestingly, in CHO cells that stably express the Mas receptor, the Ang-(1-7)-MasR mediated NO release was not affected by pre-incubation, 10 minutes before, with C21. Suggesting that the inhibition of C21 observed in the aortic ring assay, is AT2 mediated, once CHO cells do not express the AT2 receptor. The Mas/AT2 double knockout (DKO) mice in the background FVB/N have endothelial and vascular dysfunction. The main evidence provided in this study, is that Mas and AT2 receptors form heterodimers and that this heterodimerization has functional relevance that was observed in several invivo and invitro assays.Universidade Federal de Minas GeraisUFMGTransferência ressonante de energia de fluorescênciaSistema renina-angiotensina FisiologiaReceptor MASReceptor tipo 2 de angiotensinaDuplo nocaute Mas/AT2FisiologiaFisiologiaEvidências de uma interação direta entre os receptores Mas e AT2info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALtese_daniel_villela_final.pdfapplication/pdf4888307https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUBD-9D8GKJ/1/tese_daniel_villela_final.pdf0f232274d274fa8041897c38744a1aedMD51TEXTtese_daniel_villela_final.pdf.txttese_daniel_villela_final.pdf.txtExtracted texttext/plain126903https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUBD-9D8GKJ/2/tese_daniel_villela_final.pdf.txt2feb01ab759374b94e6716c526bfce3aMD521843/BUBD-9D8GKJ2019-11-14 10:17:54.035oai:repositorio.ufmg.br:1843/BUBD-9D8GKJRepositório de PublicaçõesPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2019-11-14T13:17:54Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false |
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