Evidências de uma interação direta entre os receptores Mas e AT2

• Autor(a) principal: Daniel Campos Villela
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/BUBD-9D8GKJ
• topic: Fisiologia; Transferência ressonante de energia de fluorescência; Sistema renina-angiotensina Fisiologia; Receptor MAS; Receptor tipo 2 de angiotensina; Duplo nocaute Mas/AT2; Fisiologia

O receptor para angiotensina II, subtipo 2 (AT2) e o receptor Mas para Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)], possuem ações fisiológicas protetoras semelhantes. Estudos mostram interações funcionais entre os receptores Mas e AT2, no entanto um estudo específico focado na interação Mas/AT2 , ainda não foi realizado. Este estudo demonstra uma interação molecular e funcional entre os receptores Mas e AT2. A interação molecular Mas/AT2 foi avaliada por transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), realizada em células HEK-293 vivas utilizando vetores de expressão que codificam os receptores Mas e AT2 fundidos à proteínas de fluorescência CFP ou YFP. A eficiência de FRET foi determinada usando o método de recuperação da fluorescência doadora (CFP) após fotodegradação da proteína aceptora (YFP). Interações funcionais entre os receptores AT2 e Mas foram avaliadas comparando os efeitos produzidos pela excitação concomitante de ambos os receptores com os efeitos produzidos pela ativação do receptor Mas ou AT2 separadamente. Avaliamos os efeitos da ativação concomitante Mas/AT2 na sensibilidade do barorreflexo em ratos espontaneamente hipertensos (SHR), na preparação de anel aórtico de ratos Wistar e na liberação de Óxido Nítrico (NO) em células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectadas. Desenvolvemos camundongos duplo nocaute para os receptores Mas e AT2 em dois tipos de background diferentes, C57BL/6 (B6) ou FVB/N, e avaliamos a função endotelial dos mesmos. Nossos resultados mostram eficiência de FRET de 10,8 ± 0,8% para a heterodimerização dos receptores Mas e AT2. Eficiência de FRET para homodimerizaçoes foram observadas, 7,4 ± 0,8% para o homodimero do Mas e 9,2 ± 0,8% para o homodimero do AT2. A Interação Mas/AT2 é específica, uma vez que (i) nenhuma eficiência de FRET foi observada quando um outro receptor de membrana (TRPC6) foi testado para heterodimerização com o Mas ou AT2, (ii) a expressão do MAS e AT2 não fluorescentes competiu com a eficiência da FRET na heterodimerizacao Mas/AT2. Adicionalmente, a mutação na Cisteína 35 (N terminal) do receptor AT2 reduziu significativamente a eficiência de FRET sugerindo que uma ligação dissulfeto envolvendo a C35 do receptor AT2, pode ser responsável pela heterodimerização entre os receptores Mas e AT2. A infusão intracérebro ventricular (ICV) de Ang-(1-7) ou do agonista do receptor AT2, Composto 21 (C21), aumentaram a sensibilidade do barorreflexo (1,0 ± 0,13 batimentos/min/mmHg) e (0,93 ± 0,12 batimentos/min/mmHg) respectivamente quando comparado aos grupos controles (0,60 ± 0,09 batimentos/min/mmHg) e (0,60 ± 0,08 batimentos/min/mmHg, p <0,05), respectivamente. Curiosamente, não houve mudança significativa na sensibilidade do barorreflexo quando o C21 foi infundido concomitantemente com a Ang-(1-7) (antes, 0,56 ± 0,04 e 3 horas após a infusão ICV 0,52 ± 0,1 batimentos/min/mmHg). No ensaio em anel aórtico, o efeito vaso-relaxante de Ang-(1-7) foi bloqueado após a administração do C21 (10-6 M) 10 minutos antes de Ang-(1-7). Curiosamente, em células CHO que expressam estavelmente o receptor Mas, a liberação de óxido nítrico Mas-Ang-(1-7) mediado, não foi afetada pela pré-incubação, 10 minutos antes, com C21. É possível, que o efeito inibitório do C21 sob a resposta vasorelaxante produzida pela Ang-(1-7) não tenha sido observado no ensaio de liberação de óxido nítrico, em razão à ausência em CHO do receptor AT2. Nos camundongos Mas/AT2 duplo nocaute com background FVB/N evidenciamos disfunção endotelial e vascular. A principal evidência fornecida neste estudo, é que os receptores Mas e AT2 se heterodimerizam e esta interação mostrase de relevância funcional, demonstrada por ensaios In vitro e In vivo.